外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）是从外周血中分离的淋巴细胞和单核细胞的总称，存在于骨髓中的造血干细胞（HSC），包括70%-90%的淋巴细胞（T细胞、B细胞和NK细胞），而T淋巴细胞的活化，在免疫应答中扮演着相当重要的角色。

细胞因子γ链共受体家族包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，它们在T细胞分化、增殖和内环境稳定中起着关键作用。他们受体包括共同的γ链（γc）和一个各自单独的受体链，下游信号激活STAT信号通路。在PBMC来源T细胞扩增和培养中最常用的细胞因子为IL-2、IL-7、IL-15和IL-21，可以促进T细胞克隆扩增，并可分化为效应细胞和记忆性T细胞^[1]。

图1 细胞因子信号通路^[1]

（1）使用肝素抗凝采血管收集外周血样本，将血液样本与RPMI1640按照1：1缓慢稀释^[2]；

（2）在15ml或50ml离心管中加入适量的Ficoll-Paque密度梯度介质；

（3）小心地将稀释后的血液缓慢加在Ficoll层上，确保界面清晰；

（4）在室温下400g离心30分钟，PBMC会形成一个清晰的环状带（白膜层），位于Ficoll层的上方；

（5）用滴管小心吸取白膜层细胞，转移到新的离心管中；

（6）加入5倍以上体积的PBS或RPMI1640，以250g离心10分钟，重复两次；

   注意：尽可能去除残余血小板；

（7）弃上清，用含有10%胎牛血清的RPMI1640重悬细胞，浓度为10⁶cells/ml。根据实验需要可选择2-3×10⁵/ml~10⁶/ml的浓度。

（1）抗体法

1. 将CD3抗体和CD28抗体按比例混合，溶于400μl无菌PBS中，充分混匀。抗体浓度为5-10μg/ml的anti-CD3抗体(Cat. No.:GMP-A018)、5-10μg/ml的anti-CD28抗体(Cat. No.:GMP-A063)。

2. 在24孔板中，每孔加入400μl抗体混合液，空白对照孔加400μl无菌PBS；

   注：24孔板在加入抗体混合液之前先用无菌PBS润洗2-3遍，避免干孔。

3. 用封口膜封好，37℃孵育2小时或4℃过夜；

4. 加细胞前，吸弃孔内残余溶液，用200μl无菌PBS洗两次，去除未结合抗体；

5. 洗板结束后，每孔加500μl细胞悬液，每样本可重复3个孔；

6. 细胞培养

   方案一：细胞稀释成2.5×10⁵cells/孔，500µl/孔，以含10%FBS，100ng/mL的IL-2的RPMI-1640完全培养基培养（37℃，5%CO₂）^[3,4]；

   方案二：将细胞稀释至2.5×10⁵cells/孔，500µl/孔。以含10%FBS，10ng/mL的IL-7、IL-15的RPMI-1640完全培养基培养（37℃，5%CO₂）^[5,6]。

   方案三：细胞稀释至2.5×10⁵cells/孔，500µl/孔。以含10%FBS，25ng/mL的IL-7、IL-15和IL21的RPMI-1640完全培养基培养（37℃，5%CO₂）^[7,8]。

   注意：高浓度（如25ng/ml）的IL-7、IL-15和IL-21适用于需要快速扩增和增强T细胞功能的场景，而低浓度（如10ng/ml）的IL-7和IL-15则更适合维持T细胞的长期稳定性和记忆细胞特性。

（2）磁珠法

1. 磁珠清洗:将 anti-Human CD3/CD28 Beads(Cat. No.:GMP-B016)磁珠重悬后，取适量的磁珠到新的无菌 EP 管中，加入 1mL PBS (pH7.4)重悬，混合 3-5min，置于磁力架上分离磁珠 1min，去掉上清，加细胞培养基重悬待用；

2. 细胞激活:将洗好的磁珠加入到已分离的PBMC细胞中，重悬到1-2×10⁶cells/mL确保按照下表推荐用量添加磁珠，并添加IL-2(Cat. No.:C013)，置于37℃，5%CO₂培养箱培养；

   

   注意：添加IL-2，建议使用浓度为100ng/mL，可根据实际反应体系进行调整及优化。

3. 细胞扩增:细胞密度超过2.5×10⁶cells/mL或者培养基变黄时，将细胞转移到更大的培养器皿中并用新的含有IL-2的培养基稀释到0.5-1×10⁶cells/mL，并记录细胞活率及扩增倍数，培养14-21天后收集细胞;

   注意：利用磁珠法体外扩增和培养T细胞的过程与抗体法类似。利用磁珠培养得到的细胞若想要上流式，需要在染色前将磁珠除去，将含有细胞的管子置于磁力架上1-2min，然后将含有细胞的上层液体转移至新的管子中即可分离磁珠。

（1）扩增倍数：分别于培养第0天、第7天、第14天、第21天对细胞进行计数，计算细胞扩增倍数，评估T细胞的扩增能力。

（2）凋亡水平：使用PI染料通过流式细胞术检测细胞活死比例，衡量凋亡水平，或使用台盼蓝染色测定细胞活死比例；

（3）亚群分析：分别于培养第0天、第7天、第14天、第21天通过流式细胞术分析细胞CD45RA和CD62L表达情况，判定T细胞亚群。其中：Tn细胞(CD45RA+CD62L+)，Tcm细胞(CD45RA-CD62L+)，Tem细胞(CD45RA-CD62L-)和Teff细胞(CD45RA+CD62L-)^[8]。

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Expansion of the human PBMCs. Cells were stimulated with Anti-Human CD3/CD28 Beads (Cat. No.:GMP-B016) , and expanded with human IL-2 (Cat. No.:C013) for 14 days.(Data were kindly provided by Novoprotein's customer. Thanks for her contribution)

Expansion of the human PBMCs. Cells were stimulated with Anti-Human CD3/CD28 Beads (Cat. No.:GMP-B016) , and expanded with human IL-2 (Cat. No.:GMP-C013) for 14 days.